Elaboración de guiones para el estudio interactivo de la relación estructura-función de proteínas

Proteínas SNARE:

Introducción


Todas las células eucariotas contienen numerosos orgánulos rodeados por membrana cuyas funciones requieren distintos tipos de proteínas. Estas proteínas se originan en el RE, y deben ser organizadas y repartidas por vesículas de transporte a su destino correspondiente dentro o fuera de las células mediante el tráfico intracelular de membranas. Tiene por tanto, una gran relevancia en multitud de procesos fisiológicos, como la liberación de los neurotransmisores o el transporte de enzimas desde el aparato de Golgi hasta los lisosomas. Cabe destacar que cuando las vesículas de transporte llegan a su destino, se fusionan con otra membrana, lo que permite la liberación de su carga proteica. La fusión de estas membranas lipídicas (Figura 1) depende de las proteínas SNARE, de ahí su gran importancia.

Imagen del resultado
: Fusión de membranas en el tráfico intracelular (tomada de Ungar and Hughson, 2003).


Las proteínas SNARE (del inglés SNAP REceptors o receptores de SNAP), constituyen una superfamilia de proteínas que cuenta con más de 60 diferentes entre mamíferos y levaduras. Tienen una secuencia conservada de alrededor de 60 aminoácidos denominado dominio SNARE ricos en heptadas repetidas como veremos más adelante que actúa como una cremallera cuando interaccionan varios dominio sSNARE formándose un complejo super-helicoidal de cuatro hélices ( Coiled coil o rollo-enrollado) muy estable cuya disociación requiere de aporte energético en forma de ATP y de la acción de otras proteínas como veremos más adelante (NSF y SNAP). El complejo SNARE está constituido por tres proteínas diferentes: una en la membrana de la vesícula y dos en la membrana del terminal.
Las proteínas SNARE se pueden clasificar según dos nomenclaturas. En primer lugar, según su localización tenemos las v-SNARE, que se encuentran en la vesícula de transporte y las t-SNARE, que se encuentran en la membrana diana (Figura 1). Por otro lado, de acuerdo con su composición tenemos las R-SNARE, que se caracterizan por aportar una arginina en el núcleo del complejo SNARE y las Q-SNARE, que proporcionan glutamina. Normalmente, las R-SNARE se corresponden con las v-SNARE y las Q-SNARE con las t-SNARE.
Al tratarse de una familia proteica tan amplia, vamos a centrarnos en las proteínas que se encargan de la fusión sináptica de vesículas con la membrana presináptica para la liberación del neurotransmisor ya que se trata de uno de los procesos más estudiados en este campo. En este caso, la proteína presente en la membrana de la vesícula es la sinaptobrevina y las de la membrana diana son la SNAP-25 (del inglés Soluble NSF Attachment Protein o proteína unida a NSF soluble) y la sintaxina.

Estructura del complejo SNARE


Como hemos mencionado anteriormente, la estructura del complejo SNARE consiste en un haz de cuatro hélices alfa paralelas (four helical bundle), altamente compactadas, correspondientes a las proteínas sinaptobrevina (en rojo en el modelo siguiente), presente en la vesícula sináptica (v-SNARE), sintaxina (amarillo) y SNAP-25 que aporta dos hélices, motivo N-terminal (azul) y C-terminal (verde); estas dos últimas presentes en la membrana presináptica (t-SNARE). Además, existe una quinta alfa-hélice menos retorcida que corresponde a la complexina (en rosa), proteína que estabiliza el complejo SNARE.

Estructura del complejo SNARE estabilizado con complexina.

En la secuencia primaria de las hélices alfa encontramos un patrón de heptadas repetidas de residuos hidrofóbicos, lo que favorece la formación del haz de hélices alfa paralelas que coloca todas las cadenas laterales hidrofóbicas en la misma cara de la hélice, escondidas en el interior del haz de cuatro hélices. Además, existe una capa polar central en la que una cadena lateral altamente hidrofílica de cada motivo SNARE se incrusta dentro del núcleo hidrofóbico del haz. Una arginina (R) ( R56 de la sinaptobrevina) y tres residuos de glutamina (Q) ( Q226 de la sintaxina y Q53 y Q174 de SNAP-25) componen esta capa polar, formando una red de puentes de hidrógeno alejada del solvente. Esta capa, que puede observarse en el siguiente modelo, parece que favorece la alineación de las cuatro hélices entre sí.

Detalle de la capa polar central del complejo SNARE.

Acoplamiento y fusión de membranas.


Como se ha explicado antes, tanto sinaptobrevina, como sintaxina y SNAP-25, poseen dominios específicos que interaccionan entre sí a modo de cremallera que se cierra desde los extremos N-terminales en dirección a los C-terminales. De esta forma, se genera el complejo de cuatro hélices extremadamente estable que permite la aproximación de la membrana vesicular a la membrana plasmática y que precede a la fusión de membranas. Sin embargo, la liberación de neurotransmisores no requiere únicamente de la presencia de las v o t-SNARE, sino también de otros factores determinantes como Munc18 y Munc13 (Figura 2).
Munc18 interacciona con sintaxina; esta última tiene dos conformaciones, una auto-inhibida (cerrada) y otra abierta. La conformación cerrada impide la interacción con los dominios SNARE de sinaptobrevina y SNAP-25 y se mantiene gracias a Munc18 actuando a modo de capuchón y evitando el paso al estado abierto (Figura 2B.1).
La correspondiente transición del estado cerrado al abierto de la sintaxina y en última instancia, la formación del complejo SNARE (four helical bundle), requiere de Munc13 (Figura 2B.2). Al igual que Munc18, esta proteína de 200kDa también es necesaria para la liberación del neurotransmisor. Entre sus dominios a destacar, encontramos MUN, encargado de catalizar tal transición.
Es posible que ambas proteínas no solo eviten que el complejo SNARE sea disociado por la acción conjunta de NSF-SNAP, como se explicará más adelante, sino que debido a su tamaño, evita que se produzca el acercamiento de las dos membranas a la vez que el complejo SNARE realiza la acción contraria, actuando como un mecanismo regulador de este proceso. Además, la combinación de las fuerzas opuestas ejercidas podría tener un papel esencial en la fusión de membranas al iniciar su curvatura y posterior desestabilización (Figura 2B.2 y 3).

Imagen del resultado
Modelos de fusión de membranas mediada por proteínas SNARE, Munc18 y Munc13 (tomada de Fernández-Chacón & Rizo, 2015).

Por otro lado, cabe destacar que los dominios SNARE de la sinaptobrevina y sintaxina están conectados a dominios transmembrana ( TMDs) por el C-terminal vía una región ‘linker’ corta, que hace que ambas estén embebidas en sus respectivas membranas por este anclaje con TMDs (Figura 3). SNAP-25 por el contrario, consiste en dos dominios SNARE, conectados por otro ‘linker’ y unidos a la membrana por múltiples colas de palmitoil. Las regiones ‘linker’ sirven como maquinaria de transmisión de la fuerza, es decir, envían el estrés generado por la formación del complejo SNARE hacia las membranas, desencadenando la fusión. Es por ello que su eficacia viene determinada no solo por la flexibilidad, sino también por su rigidez, ya que una gran rigidez implica una dificultosa reorientación del complejo SNARE e impide el acercamiento de membranas.

Imagen del resultado
Modelos estructural del complejo SNARE embebido en una membrana lipídica (tomada de Han J, Pluhackova K and Bökmann RA (2017). Front. Physiol. 8:5).

El mecanismo de fusión de membranas desencadenado por las proteínas SNARE tiene similitudes con lel llevado a cabo por las proteínas de fusión víricas.

La unión de complexina estabiliza el complejo SNARE.


Debemos destacar la importancia de proteínas adicionales que participan en el ensamblaje y desensamblaje del complejo, tal es el caso de la complexina vista más arriba, que se une fuertemente al complejo y es esencial para la liberación eficiente de neurotransmisores provocada por la afluencia de Ca+2.
Un análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) reveló que la complexina carece de una estructura terciaria, pero contienen una región en alfa-hélice, antiparalela a las otras cuatro hélice alfa del complejo SNARE (ver enlace 1), situada en el medio de su secuencia, y que es la responsable de la unión al complejo; el extremo C-terminal de la hélice de complexina se une al centro del surco que se forma entre la sinaptobrevina y sintaxina, mientras que el extremo N-terminal de la hélice no contacta directamente con el complejo SNARE. Esta unión causa cambios estructurales mínimos e involucra una compleja red de interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno e interacciones iónicas entre los residuos 48-70 de la complexina y las secuencias que abarcan los residuos 47-68 de la sinaptobrevina, y los residuos 214–232 de sintaxina. Dos tirosinas (Y52 e Y70), tres residuos de arginina (R48, R59 y R63) y un residuo de lisina (K69) de la complexina parecen ser críticos para la unión al complejo SNARE. En el siguiente modelo se destaca la interacción de los residuos Y70 y K69 (en azul) de la complexina con D214 y D218 de la sintaxina (en verde).

Residuos de complexina que interaccionan con el complejo SNARE.

Además, en el siguiente modelo, se ilustra la proximidad a la interfaz complexina/complejo SNARE de tres residuos aromáticos próximos de la sintaxina ( Y235, H239, y Y243).

Residuos importantes en la interfaz complexina-complejo SNARE.

Separación del complejo SNARE.


Una vez que las proteínas SNARE han hecho su trabajo, deben desmontarse y reciclarse para poder volver a actuar. NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor), enzima de la familia de ATPasas AAA +, (ATPases Associated with diverse cellular Activities), realiza esta importante tarea; hidroliza ATP y usa la energía disponible para modificar el sitio de acoplamiento y disociar el coiled-coil formado por v y t-SNARE. Está compuesto por un anillo de seis subunidades, cada una con su propio sitio para la unión e hidrólisis de ATP, en cuyo agujero central se produce el desensamblaje de los complejos SNARE. En el siguiente modelo se observa la oligomerización del dominio de unión a ATP de seis monómeros de NSF.

Hexamerización del dominio de unión a ATP de NSF.

Aspectos de interés:

Toxina botulínica:

La toxina botulínica es una toxina producida por Clostridium botulinum. Es la toxina más potente conocida. La inhibición de la liberación de los neurotransmisores por estas toxinas es causada por la separación del complejo SNARE. Solo es necesario que una de las proteínas que formen el complejo SNARE se separe para que se bloquee la salida de los contenidos vesiculares al ambiente extracelular. La toxina botulínica realiza una degradación proteolítica de la sinaptobrevina la cual se encarga de liberar acetilcolina al unirse a SNAP-25 y a la sintaxina como hemos visto más arriba. Esto provoca que no se produzca la contracción muscular y por tanto, una parálisis flácida que acaba con la muerte del individuo por parada cardio-respiratoria. En cantidades mínimas da lugar a un músculo inhábil de contraerse por lo que se puede utilizar en campos como medicina (estrabismo, hiperhidrosis severa, distonía cervical, etc.) o cosmética (botox). En el siguiente esquema se resume el mecanismo de acción de la toxina botulínica: la toxina botulínica se une a la membrana (1), se integra en el elemento presináptico (2) y se libera al citoplasma (3). Allí degrada proteolíticamente alguna de las proteínas del complejo SNARE (4) impidiendo que éste se forme y por tanto la liberación de la acetilcolina de la vesícula al espacio sináptico.

Imagen del resultado
Mecanismo de acción de la toxina botulínica. A, B, C, D, E, F: distintos tipos de toxina botulínica; LC, HN, HC: dominios de la toxina botulínica (LC, cadena ligera con actividad endopeptidasa); ACh: acetilcolina; AchR: receptor de acetilcolina ( tomada de Turton, et al. 2002).

Un efecto parecido tiene la toxina tetánica que impide la liberación de inhibidores de acetilcolina produciendo una contracción simultánea de músculos antagonistas y finalmente la muerte por asfixia.

Esquizofrenia:

La esquizofrenia es una enfermedad cuya causa es poco conocida. Diversos grupos de investigación han observado un aumento en la expresión de proteínas SNARE como una isoforma de la sintaxina o de algunas isoformas de la proteína Munc18 en individuos con esquizofrenia en estudios postmortem. También se produce un aumento de la cantidad de los complejos SNARE en la corteza prefrontal de individuos con esquizofrenia. Sin embargo, también se produce la disminución de alguna de las formas de los complejos por lo que un desbalance en la interacción entre las proteínas SNARE (especialmente sintaxina-1A) y munc18-a podría ser la base de esta enfermedad.

Marcador de enfermedades neurodegenerativas:

Una de las nuevas aproximaciones en las que se está trabajando es en la utilización de estos complejos SNARE como marcador en enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer (sobreexpresión de sintaxina). Por otro lado, se ha visto que diversos polimorfismos en SNAP-25 se pueden asociar a hiperactividad o déficit de atención. Finalmente, en individuos fallecidos por la enfermedad de Huntington se detectó una disminución de los complejos SNARE.

Papel en el transporte de glucosa (diabetes):

En los adipocitos, la capacidad de translocar glucosa por parte del transportador GLUT4 viene dada por una serie de complejos SNARE. Diversos experimentos han sugerido que una alta concentración de glucosa en los adipocitos tiene un efecto tóxico en la secreción de insulina por una disminución de la expresión de las proteínas SNARE que participan en ella. Esto puede provocar en el individuo diabetes ya que no se libera correctamente la insulina y por tanto los niveles de glucosa en sangre no serán los adecuados.

Guion elaborado por Diego Pérez Fernández, Sergio San Miguel Escudero, José Antonio Sánchez Castro y Alejandro Sánchez Sánchez, alumnos de Química e Ingeniería de Proteínas, 3er curso del Grado en Biotecnología, curso 2019/20.

Cuestiones

Responder al cuestionario correspondiente en la página de Studium

Referencias


Chen, X., Tomchick, D.R., Kovrigin, E., Arac D, Machius, M., Sudhof, T.C. & Rizo, J. (2002) Three-dimensional structure of the complexin/SNARE complex. Neuron 33, 397-409.

Fernández-Chacón, R. & Rizo, J. (2015). Sinapsis: maquinarias moleculares para la comunicación neuronal. Revista SEBBM 183, 12-16

Goodsell, D. (2013). SNARE Proteins. Molecule of the Month doi: Molecule of the Month doi: 0.2210/rcsb_pdb/mom_2002_10

Han, J., Pluhackova, K. & Bökmann, R.A. (2017). The Multifaceted Role of SNARE Protein sin Membrane Fusion. Front. Physiol. 8:5, 1-17.

PDB www.rcsb.org, H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000) The Protein Data Bank URL: Nucleic Acids Research, 28: 235-242.

Rothman, J. E. & Wieland, F. T. (1996). Protein sorting by transport vesicles. Science 272, 227–234.

Torrejón Escribano, B. (2012). Cambios en la expresión y distribución de las proteínas SNARE en la célula beta pancreática y en un modelo de tejido adiposo. Tesis doctoral, Universidad de Barcelona. Dialnet, Universidad de la Rioja, 2001-2019. https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=119122

Turton, K., Chaddock, J. & Acharya, K. (2002). Botulinum and tetanus neurotoxins: Structure, function and therapeutic utility. Trends Biochem Sci 27, 552–8.

Ungar, D. & Hughson, F.M. (2003). SNARE protein structure and function. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 493–517.