La fenilalanina (Phe) es un aminoácido esencial de cadena lateral aromática estrechamente relacionado con la tirosina (Tyr), aminoácido no esencial que se diferencia de la fenilalanina por la presencia de un grupo hidroxilo en el anillo aromático. La enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH) es la principal enzima implicada en la regulación de los niveles de Phe.
La PAH cataliza en el hígado el primer paso de la degradación de Phe que consiste en la hidroxilación del anillo aromático para sintetizar Tyr. Normalmente, el 75 % de la Phe se oxida a Tyr, y el 25 % restante se incorpora a las proteínas.
La reacción requiere del cofactor tetrahidrobiopterina (BH4), que se oxida en presencia de oxígeno a dihidrobiopterina (BH2). La PHA es una oxidasa de función mixta: en la reacción, un átomo de O se convierte en el hidroxilo de la Tyr y el otro átomo se reduce a H2O. La BH4 se regenera mediante una reacción de reducción de BH2 dependiente de NADH catalizada por la enzima Dihidropterina reductasa.
En bacterias, la PHA es un monómero mientras que en mamíferos es un homotetrámero, dímero de homodímeros.
Cada cadena polipeptídica, de 452 aminoácidos y 52 kDa, está organizada en tres dominios: un dominio regulador en el extremo N-terminal, (trazo verde en la estructura), un dominio catalítico central (en modelo de cintas en la estructura) y un dominio de tetramerización en el extremo C-terminal (mostrados en trazo más abajo en el segundo modelo).
El dominio N-terminal bloquea físicamente la entrada al sitio activo de la enzima, controlando el acceso del sustrato Phe y del cofactor BH4. También puede interactuar con ambos y con inhibidores de catecolaminas para regular la activación de la enzima.
El sitio catalítico contiene una “jaula” hidrofóbica que rodea al sustrato Phe, altamente hidrofóbico (mostrado en el siguiente modelo). En el sitio catalítico se unen un átomo de hierro que interactúa con dos residuos de His más próximos y un residuo ácido más lejano, y el cofactor BH4.
La PAH controla el catabolismo de la Phe e indirectamente la tasa de síntesis de proteínas y de neurotransmisores, ya que la Tyr es la precursora de las catecolaminas. Además, la Phe y los productos de su degradación son neurotóxicos, por lo que la PAH está sometida a una estricta regulación mediante tres mecanismos diferentes:
a) Activación por fosforilación. La Proteína quinasa A (PKA) fosforila PAH en un único residuo de Ser del dominio
N-terminal regulador (en verde en el modelo mostrado más abajo). La fosforilación de la Ser16 induce un cambio conformacional que desplaza al dominio regulador y facilita la unión del sustrato Phe en el dominio catalítico.
b) Inhibición por el cofactor BH4, que interacciona con el dominio regulador impidiendo su fosforilación y facilitando el bloqueo del sitio activo. BH4 es importante para la estabilidad de la enzima,
protegiendo el sitio activo del daño de las especies reactivas de oxígeno.
c) Activación por sustrato. La Phe puede unirse al sitio activo donde se hidroxila y al sitio alostérico donde regula la activación de PHA.
La unión de Phe al sitio alostérico induce cambios conformacionales que desplazan BH4 en el sitio activo, liberando su interacción con el dominio N-terminal regulador que a su vez queda expuesto para ser fosforilado.
La PAH está íntimamente relacionada con otras enzimas del catabolismo de los aminoácidos aromáticos: la tirosina hidroxilasa que cataliza la hidroxilación de Tyr en la primera reacción de la síntesis de catecolaminas, y la triptófano hidroxilasa, que cataliza el paso limitante de la síntesis de serotonina. Las tres enzimas pertenecen a la familia de enzimas denominada “aminoácido aromático hidroxilasas”, monooxigenasas que contienen hierro no hemo, utilizan el cofactor BH4, funcionan como tetrámeros y presentan la misma organización estructural en tres dominios. El dominio C-terminal está muy conservado en las tres enzimas, pero no así el dominio regulador N-terminal.
La fenilcetonuria (FCU) es la enfermedad genética más importante relacionada con el metabolismo de los aminoácidos, con una incidencia en la población de 1:10.000. Bioquímicamente se caracteriza por la acumulación de Phe, y la carencia de Tyr. El exceso de Phe puede metabolizarse a fenilpiruvato, un compuesto fenilcetónico presente en la orina de personas que padecen fenilcetonuria y del que toma nombre la enfermedad.
La enfermedad puede deberse a defectos genéticos de la PAH y, más raramente (aproximadamente en el 2 % de los casos), a defectos de las enzimas necesarias para sintetizar la tetrahidrobiopterina (BH4), o para su regeneración es decir, defectos de la dihidropteridina reductasa (ver la Reacción 2).
Los síntomas de la FCU afectan al sistema nervioso central provocando discapacidad intelectual grave, retraso en el desarrollo, microcefalia y convulsiones, síntomas que en casos no tratados pueden observarse a la edad de un año. Las causas del retraso mental no se conocen completamente. Se cree que pueden deberse a las altas concentraciones de fenilpiruvato que sería tóxico para el cerebro. También hay indicios de que la propia Phe sería neurotóxica.
El diagnóstico precoz de la enfermedad es importante porque puede tratarse con medidas dietéticas, como mínimo, hasta que se complete la maduración del cerebro. Por ello, en los recién nacidos se realiza la “prueba del talón” para la detección temprana de la enfermedad. Mediante esta prueba se detectan los niveles de Phe en sangre de los neonatos con FCU, que pueden llegar a ser 20 veces superiores a los normales.
El tratamiento eficaz de esta enfermedad consiste en la restricción alimentaria de Phe. La Phe se consigue mantener en sangre en niveles próximos a los normales mediante la administración de preparados de aminoácidos sintéticos sin Phe que se complementan con alimentos naturales como frutas, verduras, cereales, seleccionados por su bajo contenido en Phe. El tratamiento debe comenzar en los primeros 7-10 días de vida para prevenir el deterioro cognitivo. Se recomienda restringir la Phe de los alimentos durante toda la vida.
La FCU es un trastorno autosómico recesivo, siendo 2 % de la población portadores heterocigóticos. El gen de la PAH se localiza en el cromosoma 12, abarca 90 kb del ADN genómico y contiene 13 exones separados por intrones
En el gen humano de la PHA se han cartografiado más de 500 mutaciones diferentes. La mayoría de las mutaciones provocan cambios de aminoácidos; también hay mutaciones de corte y empalme, de finalización, silenciosas y deleciones e inserciones. Muchas de estas mutaciones están recogidas en la base de datos “Phenylalanine Hydroxylase Locus Knowledgebase” http://www.pahdb.mcgill.ca/.
En la imagen siguiente se recogen algunos ejemplos de mutaciones marcadas en rojo. Estas mutaciones interfieren en la interacción de la enzima con el átomo de hierro (en naranja) o con el cofactor BH4 (en verde), reduciendo o eliminando la actividad enzimática.
Muchas de las mutaciones sin sentido provocan defectos en el plegamiento de la proteína. Los monómeros mal plegados tienden a asociarse a través de las regiones hidrofóbicas expuestas y forman grandes agregados proteicos.
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“Phenylalanine Hydroxylase Locus Knowledgebase”.http://www.pahdb.mcgill.ca/